KRAS G12C明星抑制剂的进击之路（下）-AMG510高歌猛进

经过大量的优化工作，Shokat小组确定的早期HITS被MatthewR. Janes等修改，以提供一种适合体内应用的化合物，ARS-1620。早在Shokat实验室最初披露研究成果之前，Amgen公司已经开始确定KRAS G12C的共价抑制剂的研究，利用Carmot的技术平台得到了化合物1，如下图1所示[1][2][3][4]。

化合物1与GDP-KRAS G12C的共结晶揭示了化合物1相对于ARS-1620采用了一种新的结合模式，1的四氢异喹啉环占据了KRAS表面先前未被开发的隐袋，该口袋由组氨酸-95侧链的旋转揭开，并包含部分H95、Y96和Q99。如下图1所示尽管与ARS-1620相比，这个隐蔽口袋的接合导致细胞效力提高了数倍，但化合物1在啮齿动物模型系统中存在非常高的清除率和低的口服生物利用度，使其不适合在体内使用。寻求利用H95/Y96/Q99隐蔽口袋的替代方法，这种口袋可能会提供具有更好药用性能的线索[4]。

图1. ARS-1620(蓝色)与化合物1 (粉红色)的GDP-KRASG12C结合模式的比较

同时ARS-1620虽然该加合物在体外和体内对KRAS G12C突变的肿瘤显示出良好的抗增殖活性，但为了得到治疗上有用的分子，细胞效力的进一步提高似乎是必要的。

化合物1和ARS-1620的结合模式的叠加表明，取代ARS-1620的喹唑啉酮氮(N1)可能提供一种进入H95隐袋的替代手段，从而产生新的、增强效力的KRAS G12C抑制剂[4]。

图2. 化合物1和ARS-1620的结合模式的叠加概念图

制备了一系列酞嗪类似物来验证假设，其中酞嗪核心(X=N，Y=C)的C4位置(Y)被一系列芳基取代。测量了SOS1催化的GDP/GTP交换的抑制程度和下游ERK磷酸化信号的降低程度。研究发现C4(2)的苯基取代导致的效价比ARS-1620低约10倍(IC50=20.1 µM)，在p-ERK细胞实验中，效价比ARS-1620低20倍(IC50=58 µM)，如下图3所示[4]。

图3. 被设计接触隐袋的杂化支链化合物的生化和细胞活性

化合物2与GDP-KRAS G12C的共结晶证实了化合物2采用了类似于ARS-1620的结合模式，但新引入的C4苯基取代基占据了设计的H95/Y96/Q99隐袋，如下图4a所示。然而，C4苯基未能与隐袋残基(例如Y96)进行许多非共价接触，这促使研究进一步的苯环取代是否会与隐袋残基产生额外的接触，从而提高效力。在2的苯环上添加了一系列越来越大的邻位取代基(见上图化合物3-8)。化合物8被证明是最优的，然而，它显示了与ARS-1620相当的生化和细胞IC50值。为了进一步提高效力，还尝试了改变化合物8的酞嗪核心的效果。值得注意的是，与8相比，喹唑啉酮9在生化和细胞效力方面有显著的改善，所得到的化合物在体外试验中的效力是ARS-1620的~3-9倍。化合物9与GDP-KRAS G12C的共结晶证实了9采用了异丙基苯基与隐袋的Y96、H95和Q99残基紧密接触的结合模式，以及异丙基苯环和酞嗪环几乎正交取向的结合模式，如下图4b所示[4]。

图4.化合物2和9KRAS G12C的X射线晶体学研究

同时通过手性色谱分离R-和S-阿托品证实(R)-9的效力明显高于相应的(S)-9阿托品，如下图5所示。虽然(R)-9被证明是KRAS G12C信号的一种特别有效的抑制剂(p-ERKIC50=0.130 µM)，但GDP-KRAS G12C共晶结构提出了几个进一步优化的前景：(1)哌嗪C2位的取代似乎提供了通过与C12、E62和Y96更多接触来增强活性的机会，以及(2) (R)-9的氟酚“尾”的取代似乎提供了与亲脂残基形成更广泛接触的机会。此外，尽管(R)-9的药效前景看好，但PK研究显示在BALB/c小鼠中没有可测量的口服生物利用度。较低的膜通透性和相对较差的水溶性被认为是可能的致病因素。因此，C2和C7修饰也被视为调节(R)-9的生物药学特性以提高未来类似物生物利用度的潜在机会，如下图5所示[4]。

图5.优化(R)-9的哌嗪取代基(R2)和亲脂性“尾部”(R1)区域提高效力和生物利用度

对(R)-9进行修饰，用更大的基团取代了它的C7氟酚部分，这些基团旨在与“尾部”子袋中的残基进行额外的接触。在继续使用ERK磷酸化实验作为主要筛选的同时，也使用KRAS p.G12C(MIA Paca-2)和KRAS p.G12S(A549)细胞筛选以确认生长抑制活性仅针对p.G12C突变的细胞。萘酚(10)和吲唑(11)取代物确实在ERK磷酸化和活性测定中显示出增强的活性，但是这些类似物继续显示出较差的水溶性、低的MDCK渗透性，如上图5所示[4]。

为了提高MDCK的通透性，研究了去掉(R)-9中的酚类部分得到氟苯基(12)的效果发现这种修饰在p-ERK和活性测定中都没有活性损失，而MDCK通透性增加了3倍多。在引入哌嗪C2-甲基取代基的相关类似物中也保留了良好的MDCK渗透性，甲基哌嗪(13)不仅进一步改善了细胞活性(p-ERKIC50=47 nM)，而且还显示了可测量的小鼠口服生物利用度(12%)。用更大的亲脂取代基(例如邻氯苯基(14)或邻三氟苯基(15))取代13的氟苯基尾部的尝试导致细胞活性和MDCK通透性降低。同样，虽然在13中重新引入酚类部分(以提供氟苯酚(16))对细胞活性的影响很小，但膜的通透性显著降低[4]。

由于(R)-9和(R)-16的酚性官能团成为这些类似物降低MDCK渗透性的关键因素，研究一种替代策略来减轻这种不利影响。假设膜扩散过程中苯酚的去溶剂化增加了膜渗透的能量成本，研究喹唑啉酮环C8位的氮掺杂是否可以通过提供一个内部氢键受体来满足膜渗透过程中相邻的酚类供体，从而提高MDCK的渗透性。结果氮喹唑啉酮(17)和(18)与它们的非氮杂同系物(9和16)相比，不仅表现出显著的MDCK通透性，而且还显著改善了水的溶解性。化合物17的口服生物利用度仍令人失望(1.3%)，而氮喹唑啉酮18的口服生物利用度显著提高(33%)，细胞活性显著增强(p-ERK IC50=44 nM；MIA Paca-2活性IC50=5 nM)。综合考虑MDCK的渗透性、生物利用度、体内清除率、效力、代谢稳定性、水的溶解性决定对18进行进一步优化[4]。

随后的研究发现化合物18的一个新挑战，虽然异丙基苯基-喹唑啉酮联芳键键的空间拥挤环境极大地限制了旋转，导致了可分离的阿托异构体的产生，但它并没有完全限制围绕这个键的旋转。异构体在25°C下发生缓慢的相互转化，半衰期为8天，相互转化自由能垒为26kcal/mol，这将极大地使(R)-18作为纯物质的发展复杂化，如下图6所示[4]。

图6.化合物18阿托异构体在25°C时构型不稳定

启动三种策略来识别具有阿托异构体构型特性的先导化合物，以适合药物开发需要。这些策略包括：(1)提高阿托品异构体相互转化的能量势垒，以形成单一的纯阿托品；(2)降低相互转化势垒，以形成自由相互转化的阿托混合物；或(3)使隐袋取代基对称，以避免手性轴的产生。经过研究(R)-24成为随后在异种移植模型中进行药效学和有效性测试的主要候选药物[4]。

图7.阿托异构体稳定性和KRASG12C活性与隐袋芳烃特性和取代方式的关系

检测(R)-24对体内KRAS信号转导的影响，将(R)-24口服给裸鼠皮下接种MIA-Paca-2T2人肿瘤细胞(纯合KRASp.G12C)，观察(R)-24对KRAS信号转导的影响。血清和肿瘤样本在给药2小时后收集，显示(R)-24在不同剂量(10-100 mg/kg)之间呈剂量比例暴露，在低剂量(30 mg/kg)时最大限度地抑制了下游ERK的磷酸化(图8a)。30 mg/kg剂量组的游离血浆和总肿瘤暴露(分别为3和11 nM)明显低于体外p-ERK IC50(28 nM；孵育2小时后测定)，这提供了一个初步的迹象，表明KRAS G12C的共价失活可能具有持久的下游效应，即使在没有循环药物的情况下也是如此。随后在裸鼠移植瘤有效性研究中使用相同的方法对(R)-24进行了分析。(R)-24在肿瘤建立后两周内每天口服一次(10-100毫克/公斤)，在30毫克/公斤剂量下完全抑制肿瘤生长，在60毫克/公斤剂量下引起肿瘤消退(图8b)。(R)-24在裸鼠体内的时程PK研究(30mg/kg，PO)再次证实了早期PK/PD研究的结果，表明体外2h p-ERK IC50的体外处理<2-3h足以实现肿瘤生长停滞(图8c) [4]。

图8.(R)-24动物试验结果

随后研究发现(R)-24晶型与早期研究中使用的非晶型相比，口服生物利用度显著降低(4-12%)时，这削弱了在未来研究中实现适当血浆暴露的能力。由于生物利用度降低的同时，生物悬浮介质中的溶解度也大幅降低，因此优先确定具有优异水溶性的(R)-24类似物。采用两种策略：(1)通过改变喹唑啉酮C6卤素取代基降低(R)-24的亲脂性，(2)通过在隐袋环中引入额外的氮原子来增加(R)-24的极性表面积，如下图9所示[4]。

图9.(R)-24的生物制药优化显著提高了生物利用度

最初集中在将氮原子加入到神秘的口袋环中。用氮原子(见化合物34和35)取代异丙基或甲基取代基附近的碳原子显著提高了水的溶解性，而不会明显改变KRAS的活性。然而，这种替代也大大降低了MDCK的渗透性，提供了没有可测量的口服生物利用度的分子(BALB/c小鼠)。虽然双氮取代(36)同样进一步提高了水的溶解性，但所得到的嘧啶类似物同样具有低渗透性，并且没有可测量的口服生物利用度。接下来研究了降低喹唑啉酮C6取代基的亲脂性是否可以在保持细胞活性的同时提高水的溶解性。虽然用氟取代基(R)-24的C6氯取代基(化合物37)导致细胞分析中的活性略有下降(例如，p-ERK IC50=90 nm)，但这一改变也导致水溶解度略有增加(~3倍)，并且对膜的通透性没有不利影响。但(R)-37没有显示出任何可测量的口服生物利用度(%F<0.5)。然而，将C6氟取代与隐蔽口袋芳烃环(化合物38-40)中的氮掺入相结合，克服了之前类似物一贯的低生物利用度。虽然氮原子的加入再次导致所有三种化合物的MDCK渗透率显著降低，但这一特性的结合显著提高了水的溶解度(在所有生物悬浮介质中均大于423µM)。从这些研究中，(R)-38成为突出的分子，在细胞分析中表现出良好的活性(p-ERK IC50=68 nm)，中等渗透性(PAB=6 µcm/s)，以及出色的口服生物利用度(晶态为22-40%)，如上图9所示[4]。

令人满意的是，(R)-38在裸鼠MIAPaca-2异种移植模型中口服(0.3100 mg/kg)时呈现剂量比例的血浆暴露，并在剂量≥10 mg/kg时显著抑制ERK磷酸化(图10a)。进一步研究(R)-38的PK/PD关系，在异种移植模型中进行了时程药效学研究(图10b)。研究支持了(R)-24和(R)-38的早期结果，表明虽然ERK磷酸化在给药后60-120分钟得到最大程度的抑制，但(R)-38血浆和肿瘤暴露在给药后30分钟达到峰值，到120分钟的时间点，循环中只有低浓度的(R)-38保持不变[4]。

图10.化合物(R)-38的P-ERK(a)剂量反应和(b)血浆和肿瘤暴露的时程(MSD)

由于药效学效应的鼓舞，在一项使用MIA Paca-2 T2(p.G12C)肿瘤细胞进行的小鼠异种移植疗效研究(R)-38。每天一次口服剂量(10-100 mg/kg)在10 mg/kg时肿瘤生长抑制率达86%，在≥30 mg/kg剂量下肿瘤消退显着(图11a)。这项研究的非结合血浆暴露(图11b)再次表明，考虑到共价抑制剂的作用机制，在没有持续药物暴露的情况下，可以实现持久的生长反应。在10 mg/kg剂量下，体外p-ERK IC50的血浆覆盖率仅维持1h，给药后8h循环游离浓度已降至1 nM以下。尽管如此，体外p-ERK IC50的1h覆盖足以使肿瘤生长接近停滞，而体外IC50覆盖仅2h(30 mg/kg剂量)就足以引起肿瘤的消退[4]。

图11.a.化合物(R)-38对MIA-Paca-2T2裸鼠移植瘤生长的影响(qd，PO剂量)。b.平均游离血浆浓度

对(R)-38进行了进一步的表征，以评估其作为可能的开发候选药物的潜力。与KRASG12C的共结晶揭示了(R)-38采用了类似于先前喹唑啉酮先导化合物的结合模式，(R)-38的喹唑啉酮核心占据了KRASSwitch II口袋，丙烯酰胺部分与C12形成了共价键，如下图13所示。(R)-38的(S)-甲基哌嗪环采用螺旋船构象，C2甲基取代基与C12和Y96紧密接触。关键的是，吡啶环的异丙基再次与Y96、H95和Q99紧密接触，很大程度上填满了H95残基的侧链旋转所揭示的隐蔽口袋，并有助于该分子的效力。同时也没有发现隐蔽口袋芳环的氮取代对强效R-阿托的构型稳定性产生不利影响，如下图14所示[4]。

图13. 化合物(R)-38与GDP-KRASG12C(青蓝)键合的X射线晶体结构

图14. 化合物(R)-38的额外体外和PK表征;(R)-38化合物结构

基于(R)-38令人信服的药理学特征及其显著的体内消退KRAS p.G12C突变肿瘤的能力、良好的生物药剂学特性以及在临床前毒理学模型中出色的耐受性，Amgen于2018年将(R)-38 (AMG 510)进行临床开发。目前AMG 510已经进行到临床三期，在之前的临床试验中已经显示出一定的临床潜力。

KRAS开发从不可成药的魔咒，到Shokat和Matthew R. Janes等科学家带来的曙光乍现，再到AMG-510的高歌猛进，经历了时光，更经历了时光里的一场场风风雨雨，但到此KRAS的开发并没有结束，未来是晴空万里还只是短暂的狂欢？

参考文献：

1. Ostrem, J. M.; Peters, U.; Sos, M. L.; Wells, J. A.; Shokat, K. M.K-Ras(G12C) Inhibitors Allosterically Control GTP Affinity and Effector Interactions. Nature 2013, 503, 548–551.

2. Janes M R , Zhang J , Li L S , et al. Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor[J]. Cell, 2018, 172(3):578-589.

3. ACS Med. Chem.Lett. 2019, 10, 1302–1308.

4. Lanman B A , Allen J R , Allen J G , et al. Discovery of a covalent inhibitor of KRASG12C (AMG 510) for the treatment of solid tumors[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2019.